細胞REDOX機構
細胞内のレドックス（酸化還元）機構にはいくつかの重要なシステムがあります。以下に代表的な5種類を紹介します：
グルタチオンシステム：グルタチオンは細胞内で主要な抗酸化物質として機能し、グルタチオンペルオキシダーゼやグルタチオンリダクターゼと協力して過酸化水素などの活性酸素種を無害化します1。
チオレドキシンシステム：チオレドキシンは、酸化ストレス下でタンパク質のジスルフィド結合を還元する役割を持ち、チオレドキシンリダクターゼによって再生されます2。
スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）：SODはスーパーオキシドアニオンを過酸化水素に変換する酵素で、ミトコンドリアや細胞質に存在します1。
ペルオキシレドキシン：ペルオキシレドキシンは過酸化水素や有機過酸化物を還元する酵素で、細胞内の酸化ストレス応答に重要な役割を果たします2。
これらのシステムが協力して、細胞内の酸化還元バランスを維持し、酸化ストレスから細胞を保護しています。
タンパク質品質管理を支える小胞体レドックス環境と電子伝達
京都産業大学生命科学部／京都産業大学タンパク質動態研究所 ◇ 〒603–8555 京都市北区上賀茂本山
小胞体は分泌タンパク質や膜タンパク質のフォールディングの場として働く．タンパク質の立体構造形成に重要な翻訳後修飾であるジスルフィド結合形成を行うため，小胞体は酸化的レドックス環境を維持し，20種類を超える酸化還元酵素が存在する．このジスルフィド結合形成システムは，Ero1–PDI複合体を中心とする電子伝達経路によって，小胞体に挿入された新生ポリペプチド鎖からの電子を酸素へと受け渡すことで，ジスルフィド結合を導入する．また，酸化還元酵素が互いにネットワークを形成することで，多様な基質を効率よく酸化する．新たな計測技術の登場とともに，より詳細な小胞体での電子ネットワークの全体像が明らかになりつつある．本稿では，小胞体のレドックス環境を背景に織りなす生命の巧みなタンパク質品質管理機構について紹介したい．
© 2021 公益社団法人日本生化学会
リボソームで合成されたポリペプチド鎖は，それぞれ適切な立体構造を獲得して，はじめてタンパク質として機能を発揮することができる．細胞内では，分子シャペロンの働きによって，より正確に，より効率的に構造形成が成立する必要がある．分泌・膜タンパク質は，小胞体へ移行し，その多くがジスルフィド結合形成を伴う酸化的フォールディングを受ける．システイン残基の硫黄原子を介したジスルフィド結合は，タンパク質構造の安定性やサブユニット間の適切な配置に必要であり，その形成はタンパク質の機能発現に重要である．真核生物において，ジスルフィド結合形成を触媒する酵素としてprotein disulfide isomerase（PDI）とそのファミリータンパク質が知られており，PDIを再酸化する酵素としてER oxidoreductin 1（Ero1）が存在する．PDIは新生ポリペプチド鎖の硫黄原子から電子を授受することで酸化的フォールディングを触媒し，奪った電子はPDIからEro1へ，そしてEro1が持つflavin adenine dinucleotide（FAD）を介して分子状酸素に受け渡される．この電子伝達によって，小胞体内腔の酸化的フォールディングは成立するが，近年，PDIを含めた約20種類もの酸化還元酵素群が電子を伝達するネットワークを形成し，効率的な酸化的フォールディングを実現していることが明らかになった．さらに，PDI酸化反応を触媒する酵素が相次いで同定され，同じ真核生物でも酵母などと比べ，より複雑な酸化的フォールディングを支える分子基盤が明らかになりつつある．また，タンパク質の酸化還元状態をPDIファミリータンパク質が変えることで，ダイナミックな構造変化を引き起こし，レドックスが酵素の活性を制御する分子スイッチとして機能する例も相次いで明らかになっており，細胞内のシグナル伝達経路の一つとしても注目される．本稿では，小胞体を中心として，タンパク質構造形成を支える小胞体の酸化還元（レドックス）環境と電子伝達について解説する．
2. 小胞体のレドックス環境を理解する
1）細胞内で働くレドックス因子の酸化還元電位
化学反応として酸化還元反応が実際に起こるかどうかを判断するうえで，重要な指標として酸化還元電位（レドックスポテンシャル）がある．生体物質において標準酸化還元電位を直接，決定することは容易ではなく，仲介分子を系に導入し，電位を測定した後に水素電極電位に換算することが一般的である．したがって，相対酸化還元電位［グルタチオン緩衝系など，細胞小器官（オルガネラ）環境に対応する酸化還元物質緩衝系］に基づく議論となるが，代表的な酸化還元物質については古くから酸化還元電位が決定されている（図1A）1）．負の電位がポテンシャルエネルギーとして高い状態にあり，自発的な電子の移動は負から正の方向にのみ起こる．したがって，図1より，サイトゾルにおいて還元反応に関与するチオレドキシン（thioredoxin：Trx）とその還元酵素Trx reductase（TrxR），またその補因子であるnicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）は，レドックスポテンシャルに従って，NADPHからTrxへと電子が移動する．また，システインとシスチンの酸化還元電位を例にとると，グルタチオンと比較しても，酸化的な電位をもつ．つまり，サイトゾルでは，NADPHの還元力をもとにTrxを介した，ジスルフィド結合の還元が起こりやすい．また，グルタチオンによっても，ジスルフィド結合の開裂が起こる可能性が高いことがわかる．このようにレドックスポテンシャルに従い，サイトゾル環境ではジスルフィド結合の形成が起こりにくいといえる．一方で，小胞体内腔では，ジスルフィド結合形成が自発的に進みやすく，さらに，この反応でPDIファミリータンパク質が電子を受け取るが，PDIファミリータンパク質の酸化還元電位に注目すると（図1B），還元酵素ERdj5を例外として，PDIファミリータンパク質はいずれもシステインよりも高いレドックスポテンシャルを持つことから2），基質からPDIファミリータンパク質へ電子伝達が起こることが理解できる．
図1 細胞内の酸化還元物質のレドックスポテンシャル
（A）細胞内の代表的な酸化還元物質の半反応式と酸化還元電位（mV）を示す．酸化還元反応において，電子は電位の低い方から高い方へ移動する．また，細胞内のレドックス環境は，グルタチオン平衡系をもとに，サイトゾルが約−300 mVという還元的環境に換算され，小胞体は約−200 mVというサイトゾルと比較して酸化的な環境となっている．（B）酸化還元活性が報告されているPDIファミリータンパク質の一例．それぞれのタンパク質名／遺伝子名と酸化還元電位およびドメイン構造を示す．PDIファミリータンパク質は，CXXCからなる活性中心モチーフ含むTrx様ドメインを分子内に持つ．ERdj5は，Hsp70結合領域であるDnaJドメインを持つ．
2）小胞体の酸化的環境とは
グルタチオンは比較的高濃度（0.1～10 mM）に存在するチオール分子である．細胞内のレドックス環境は，還元型グルタチオン（GSH）と酸化型グルタチオン（GSSG）によって緩衝され，その酸化還元比（［GSH］2/［GSSG］）に基づいて，酸化還元電位を考える．サイトゾルではGSHの割合が高く（［GSH］：［GSSG］で，およそ100：1），還元的な環境とされる．このような環境下では，ジスルフィド結合が形成されることはほとんどない．対して，小胞体はGSSGの比率が高く（［GSH］：［GSSG］で，おおよそ1～10：1），相対的に酸化的な環境といえる．以前より，生化学的な手法によってGSHの量が測定され，細胞内のGSHの濃度や酸化還元比が見積もられてきた．しかし，生細胞内で正確にGSH濃度，特にオルガネラ内のGSH濃度を測定することは困難であった．GFP改変型のレドックスセンサータンパク質roGFPの開発と近年の改良によって，生細胞内においてレドックス環境の可視化が実現され，生細胞内のGSH濃度の測定が可能になった3）．驚くべきことに，小胞体の総量としてのGSH濃度は15 mMとサイトゾル全体の値（7 mM）よりも高く，小胞体膜を隔てたサイトゾルとで濃度勾配が生じることが示唆されている4）．小胞体のレドックスポテンシャルはいまだに決定的な値は定かではないが，およそ−200 mV程度と考えられている．このような環境下において，GSHやシステインがPDIファミリータンパク質によって酸化されやすいことが説明でき，PDIからEro1への電子伝達もレドックスポテンシャルから考えると進行しやすい反応であることがわかる（詳細は後述）．ただし，GSSGが多く存在するということが，直接的にジスルフィド結合形成を触媒するということではない．小胞体のレドックスポテンシャルが約−200 mVという環境のもとで平衡状態を考えたとき，チオール基として存在するよりも，ジスルフィド結合を形成した方が安定であり，その存在比が多くなるということである．また，酸化的なレドックスポテンシャルをもつPDIファミリータンパク質の活性中心は，ほとんどが開裂した還元型として存在することになり，常にドナーから電子を供給されることになる（つまり酸化酵素として機能する）．ERdj5は酸化型が多く存在することになり，常にアクセプターに対して電子を与えることになる（つまり還元酵素として機能する）．また，GSHは活性酸素種（reactive oxygen species：ROS）と反応して，酸化型へと変換される．したがって，サイトゾルの環境とは対照的に，グルタチオン平衡系におけるGSSGの比率が大きくなることで，システイン残基は必然的に還元されにくく，かつPDIファミリータンパク質によって絶えず酸化される環境にある．このことが，小胞体を酸化的フォールディングの場とし，ジスルフィド結合形成が小胞体で優位に進む理由である．
3. 真核生物におけるジスルフィド結合形成システム
1）Ero1–PDI複合体を中心とする電子伝達経路
小胞体に挿入された分泌・膜タンパク質は，小胞体で酸化的フォールディングを介して成熟する．小胞体でタンパク質のフォールディングを触媒する酵素の存在が発見されたのは1963年のことであり，StraubらとAnfinsenらのグループがそれぞれ独立して発見した5, 6）．この酵素がPDIであり，その後，遺伝子クローニングにより決定された塩基配列から，分子内に相同性の高い領域が存在することがわかった．この相同性の高い領域は，大腸菌のチオレドキシンと類似しており，チオレドキシン様ドメインと名づけられた．チオレドキシン様ドメインは，ドメイン内に活性中心モチーフCXXCを持つ7）．AnfinsenはPDIをジスルフィド結合の異性化酵素と考え，精製したリコンビナントPDIは，in vitroで高い異性化活性を示した8）．この時点で，小胞体が他のオルガネラと比較して，酸化的な環境であることはわかっていたが，まだジスルフィド結合形成メカニズムの詳細は明らかではなかった9）．PDIの発見から遅れること約40年，1998年にWeissmanとKaiserのラボにおいて独立にPDIを酸化する酵素Ero1が酵母で同定された10, 11）．翌年，Ero1の酵母ホモログEro1pがPDIを酸化し，PDIの活性中心にジスルフィド結合を形成することが明らかとなり，PDIが異性化活性だけでなく，酸化酵素として基質のジスルフィド結合形成反応に大きく寄与することが明らかとなった12）．その後，ヒトEro1は2000年にSitiaらが同定し13, 14），小胞体に挿入された新生ポリペプチド鎖のシステイン残基から電子がPDIに受け渡され，Ero1へと伝達されることが明らかになった．この電子伝達によって，新生ポリペプチド鎖にジスルフィド結合が形成され，電子を受け取ったPDIは，Ero1によって再酸化される．Ero1は活性中心にFADが結合したフラボタンパク質であり，Ero1がPDIを酸化するとき，Ero1はPDIから電子を二つ受け取る．この二つの電子はFADを介して分子状酸素（O2）へと受け渡され，還元された酸素は過酸化水素（H2O2）へと変換される（図2）．ROSの一種である過酸化水素は酸化ストレスの要因ともなりうるが，過剰に過酸化水素が産生されないように，Ero1自身の活性をシステイン残基間のジスルフィド結合を架け替えることで制御するフィードバック機構が存在する15）．Ero1は酵母からヒトまで真核生物で進化的に保存されている．酵母ではEro1pと1種類であるが，ヒトではEro1αとEro1βの2種類が存在する．Ero1αは広範な組織で発現が認められるのに対し，Ero1βは膵臓など分泌タンパク質が多く合成される組織で高い発現が認められている．このEro1αとEro1βの発現パターンの違いには，両者の転写因子の違いに起因するといわれている．小胞体内腔にフォールディング不全タンパク質が蓄積すると，いくつかの小胞体ストレスセンサータンパク質の活性化に依存して，転写因子が働き，分子シャペロンや酸化還元酵素群などタンパク質品質管理に関わる因子を誘導し，恒常性を維持する（図3）．Ero1αはCHOPによって誘導される遺伝子であり，Ero1βはATF6下流の遺伝子として小胞体ストレスによって誘導される．分泌組織の細胞はタンパク質合成が盛んであり，常に小胞体ストレスが惹起された状態と言っても過言ではない16）．Ero1βがATF6下流に存在し，分泌組織で高発現が認められることは，分泌細胞の機能と合目的的な役割が推察できる．酵母ではEro1pを欠損するとタンパク質の酸化的フォールディングが進まず，小胞体ストレスが生じ，酵母は死んでしまう．しかし，哺乳類における2種類のEro1αとEro1βの二重欠損マウスは正常に発生し，生育可能である．驚くべきことに，タンパク質の酸化的フォールディングにも異常が見られず，小胞体の酸化的環境も維持される17）．この結果から，哺乳類ではEro1以外のPDIファミリータンパク質への酸化酵素の存在が示唆され，酸化的フォールディングシステムの補完性が考えられる．
図2 小胞体におけるEro1とPrx4による電子伝達
還元状態にある基質のチオール基（–SH）は，PDIによって酸化され，2電子をPDIに渡す．還元型PDIはEro1に電子を渡し，Ero1はFADを介して分子状酸素（O2）を還元し，過酸化水素（H2O2）が発生する．H2O2はPrx4によって水（H2O）へと還元され，その酸化力はPrx4を介して，再びPDIファミリータンパク質へと伝達する．
図3 小胞体ストレス応答
小胞体に不良タンパク質が蓄積することで惹起される転写誘導を小胞体ストレス応答と呼ぶ．小胞体ストレス応答では，PERK・ATF6・IRE1の三つがストレスセンサーとして不良タンパク質の蓄積を感知し，翻訳の一時停止，分子シャペロンの発現誘導，タンパク質分解関連因子の誘導，そしてアポトーシスが引き起こされる．これらセンサータンパク質も一部レドックス制御が関わることが知られ，レドックス環境の変化は小胞体内腔のタンパク質恒常性機構をダイナミックに変化させる可能性がある．
2）小胞体内の電子伝達の全体像
Ero1の発見以降，peroxiredoxin 4（Prx4），vitamin K epoxide reductase（VKOR），glutathione peroxidase 7（Gpx7）およびGpx8の4種類の酸化酵素が相次いで報告され，NADPH oxidase 4（Nox4）も小胞体膜上で酸化酵素として機能することが報告されている18）．還元型Prx4は還元型PDIから受け取った電子を過酸化水素（H2O2）へと受け渡し，過酸化水素をさらに水（H2O）に還元する反応を触媒する（図2）．このように細胞内に過剰な過酸化水素が蓄積しないように，また効率よく電子を処理する仕組みを備えている19）．Prx4の遺伝子欠損マウスも作製されたが，前述のEro1α/β欠損マウスと同様に，正常に生育し20），タンパク質のフォールディングにも異常が認められなかった．ところが，Ero1αとβの二重欠損マウスにさらにPrx4を遺伝子欠損することによって顕著にマウスの出生率が低下することから，Ero1とPrx4の両酸化的フォールディングシステムが協調的に働くことが，初期発生において重要であると示唆される21）．Gpx7/8はグルタチオンペルオキシダーゼのファミリーとして分類されているが，他のGpxファミリーが活性中心にセレノシステインを持ちGSHの還元力を用いて基質を還元するのに対して，Gpx7/8は通常のシステインを活性中心に持ち，過酸化水素を用いてPDIファミリータンパク質の酸化に寄与する22）．Nox4はNoxファミリーに分類される酵素であり，酸素を電子受容体としてNADPHの酸化を触媒し，小胞体内にROSを産生させることによって小胞体の酸化的環境の維持に寄与することが知られている23）．PDIと相互作用することから，直接的な電子の授受も示唆されている24）．Ero1がPDIに比較的高い特異性をもってジスルフィド結合形成を促進するのに対して，これらの酸化酵素はPDIファミリータンパク質全般に対して幅広く作用していることが報告されている25）．また，Erv2［酵母にのみ存在，ヒトの相同タンパク質はquiescin sulfhydryl oxidase（QSOX）である］やER flavoprotein associated with degradation（ERFAD）といった新たなフラボタンパク質の酸化還元反応の生物学的意義は明らかになっていないが，小胞体に局在することが明らかになっている26, 27）．現在では，PDI–Ero1経路の発見当初の予想よりもはるかに複雑なジスルフィド結合形成のネットワークの存在が考えられている．
3）新生ポリペプチド鎖へのジスルフィド結合導入の新展開
ここまで小胞体内腔での酸化的フォールディングと電子伝達について論じてきたが，近年，翻訳と共役した新生ポリペプチド鎖のジスルフィド結合形成について，興味深い知見が次々と明らかになった．タンパク質の翻訳に共役して分泌タンパク質はSecトランスロコンチャネルを通過するが，リボソームとSecが結合した段階で，リボソームトンネル内の環境がサイトゾルの還元的環境から小胞体の酸化的な環境へシフトし（図4），リボソームトンネル内で自発的なジスルフィド結合形成が起こる可能性が示唆された28）．ただし，リボソームトンネル内の大きさは狭く，ポリペプチド鎖の立体構造形成はαヘリックス構造といった単純なものであり，また近接するアミノ酸残基間における酸化反応のみに限られる．また，小胞体内腔に露出した新生ポリペプチド鎖の初期段階でのジスルフィド結合形成には，積極的にERp46が関与するとの報告がある29）．ERp46はPDIファミリータンパク質の中では酸化酵素としての活性が強く，非選択的にポリペプチド中のシステイン残基を酸化し，ジスルフィド結合形成を促進していると考えられている．また，PDIはシャペロン活性も持ち合わせており，ジスルフィド結合の異性化酵素活性も高いことから，新生鎖にランダムに導入されたジスルフィド結合を天然構造型のジスルフィド結合へと校正していくメカニズムが提唱されている．このように，新生ポリペプチドのステップワイズなジスルフィド結合形成とPDIファミリーの関わりについて詳細が明らかになりつつある．
図4 新生ポリペプチド鎖へのジスルフィド結合導入
小胞体に標的化されたリボソーム新生鎖複合体．新生ポリペプチド鎖は，リボソーム–Sec61複合体を翻訳に共役して通過する．Sec61トランスロコンチャネルが開くことで，小胞体の酸化的環境が漏出し，リボソームトンネル内の局所的なレドックスシフトが起こり，リボソームトンネル内でジスルフィド結合が形成される可能性がある．
4. タンパク質品質管理機構とPDIファミリータンパク質
小胞体に挿入される分泌タンパク質の大半は糖タンパク質であり，翻訳に共役して小胞体でN型糖鎖修飾を受ける．小胞体に滞留する糖タンパク質の糖鎖構造は，小胞体のグルコシダーゼとマンノシダーゼによってトリミングされる．グルコシダーゼI, IIによって順次グルコースがトリミングされ，モノグルコース型となった糖鎖を持つ糖タンパク質は，レクチン様活性を持つ分子シャペロンCalnexin（CNX）またはCalreticulin（CRT）に認識され，糖タンパク質のフォールディングを促進する30）．また，CNXとCRTは，PDIファミリータンパク質であるERp57やERp29との結合領域をもつ．ERp57はCNXあるいはCRTを足場として，基質のジスルフィド結合形成を触媒する．ERp57はPDIと異なり，基質と直接的に相互作用するために必要な疎水性相互作用領域を持たないが，CNX/CRTと協調することで，多様な基質のジスルフィド結合形成に寄与している．ここで正しい立体構造を獲得したタンパク質は，さらにグルコースがトリミングされ，CNXおよびCRTから解離し，ゴルジ体へと輸送される．フォールディングが不完全な場合には，フォールディングセンサーとして機能するUDP-glucose：glycoprotein glucosyltransferase（UGGT）によってグルコースが再付加され，再びCNXおよびCRTによって認識され，フォールディングが再び試みられる．このような糖タンパク質の品質管理機構をCNX/CRTサイクルと呼び，糖鎖構造を“目印”とするフォールディング監視機構が詳細に解明されてきた（図5）．このようなCNX/CRTのようなレクチン型シャペロンによる厳密な品質管理にもかかわらず，この品質管理をかいくぐり，フォールディング不全タンパク質が分泌経路に進んでしまった場合，PDIファミリータンパク質であるERp44が小胞体へと再び基質を引き戻し，小胞体で再度フォールディングが試みられる．ERp44は小胞体–ゴルジ中間体に局在するPDIファミリータンパク質であり，酸化還元酵素としての活性を持ち合わせていないが，基質分子と活性中心のシステイン残基を介して分子間ジスルフィド結合を形成することができる31）．また，ERp44はカルボキシ末端に小胞体残留シグナルを持つため，KDEL受容体の働きによってERp44–基質複合体として小胞体へと逆輸送される32）．このERp44のフォールディング監視機構は，ERp44の活性モチーフに対して，フレキシブルな構造を持つカルボキシ末端領域が覆いかぶさる構造をとるか否かがpHに依存している点に特徴があり33），小胞体の中性条件とシスゴルジの弱酸性環境の違いを巧みに利用している（図6）．ERp44の代表的な基質としては，免疫応答の最初に産生される免疫グロブリンMや脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインの一種であるアディポネクチンなどの分泌タンパク質が知られている34）．これらは成熟の過程でジスルフィド結合依存的なオリゴマーを形成する．免疫グロブリンMは，最初に産生される抗体でありながら，五量体という免疫グロブリンのサブクラスの中では最も大きな構造をとるタンパク質である．抗原に対する特異的抗体の産生を活性化する古典的経路は，免疫グロブリンMと補体の結合から開始するため，小胞体におけるタンパク質品質管理が重要となる．また，アディポネクチンは，インスリン抵抗性の改善や動脈硬化の防止作用など，生体に有益な生理活性物質として注目されている．これらのさまざまな有益な効果は，三量体を基本単位として多量体化したアディポネクチンによって発揮されるため，やはりタンパク質フォールディングの厳密な品質管理が重要である．ERp44はそのようなオリゴマー化に関わるチオール基とジスルフィド結合を形成することで，未成熟なまま分泌経路へ入ってしまったフォールディング中間体の基質を小胞体へと逆輸送する．また，血圧調節に重要なアンジオテンシンの分解酵素であるERAP1とジスルフィド結合依存的な複合体を形成することで，ERAP1を細胞内にとどめる働きがあると報告された35）．ERAP1の分泌量を調節することによって，血圧の制御を行っていると考えられる．このフォールディング監視機構には，分泌タンパク質の量的制御の役割もあるといえる．このように未成熟タンパク質が分泌経路に入らないようにする仕組み，もし未成熟なタンパク質が分泌経路に入ってしまってもそれを監視し，小胞体へと再び戻す仕組みという二重の品質管理機構を備え，厳密性を担保している．
図5 糖鎖構造に依存したタンパク質フォールディング監視機構
（A） N型糖鎖のコア構造．新生鎖が小胞体に挿入されると，N型糖鎖付加部位のアスパラギン側鎖に付加される．（B）糖鎖構造に依存した糖タンパク質の品質管理．小胞体に存在するグルコシダーゼおよびマンノシダーゼによって糖鎖トリミングが進む．CNXおよびCRTはモノグルコース構造を認識し，ERp57と協調してフォールディングを介助する．グルコシダーゼIIによってグルコースがトリミングされるとCNX/CRTから解離し，フォールディングが不完全であればUGGTによってグルコースの再付加が起こる．成熟したタンパク質はゴルジ体へ輸送される．
図6 ERp44によるタンパク質輸送
ERp44は小胞体とゴルジ体の両方に局在する．小胞体（pH 7.2）でERp44の活性中心は，ERp44のC末端領域に覆われた構造をとる．このため基質タンパク質とERp44は，相互作用することができない．一方，ゴルジ体の弱酸性環境（pH 6.7）下では，ERp44の活性中心が露出し，基質タンパク質がアクセスできるようになる．ERp44のRDEL配列がKDEL受容体と結合し，ERp44–基質複合体は小胞体へと逆輸送される．
5. PDIファミリータンパク質の補完性と多様な機能
このように小胞体には多くの酸化還元酵素が存在している．これは多細胞生物に進化し，細胞間コミュニケーションの必要性が生まれることで，多種多様な分泌・膜タンパク質の立体構造形成に関与する必要が生じたと考えられるが，その理由は明確ではない．酵母においてはEro1の欠損が致死であるのに対して，動物細胞では影響が観察されなかったことは前述したが，同様にPDIも酵母においては欠損が致死であるのに対して36），動物細胞では重篤な異常はみられない．さらに約20種類存在するPDIファミリータンパク質のうち遺伝子欠損マウスで致死となることが報告されているものは，ERp57のみである37）．したがって，ERp57が初期発生に必須であることは明らかであるが，培養細胞レベルではERp57欠損細胞も生育可能である．特異的な機能をもつ酸化還元酵素がある一方で，細胞のロバストネスを担保するための酵素の存在が予想される．細胞の生死を判断基準とすると，一つの酸化還元酵素が機能不全に陥ったとしても極端な影響はみられないが，特定のタンパク質を過剰発現させるなどの負荷を与えたときには，顕著に脆弱性を示すこともある38）．それぞれのPDIファミリータンパク質の基質特異性についても精力的に研究が続けられているが39），個々の機能解析が進んでいる遺伝子もあれば，酵素活性の有無すら報告されていないものも多く，今後の解明が待たれる．
ここまでPDIファミリータンパク質による酸化的フォールディングに焦点を当て，論じたが，近年，PDIファミリータンパク質による酸化還元反応はフォールディングのみに限らず，転写因子やイオンポンプ，イオンチャネルといった生体内で重要な役割を果たすタンパク質の活性制御に関わることが明らかになってきた40–42）．これまでに我々のグループでは，小胞体のカルシウムポンプであるSERCA2bのポンプ活性を上昇させる因子として還元酵素ERdj5を報告している43, 44）．また，PDIRやERp18は小胞体ストレスセンサーATF6の制御に関わり45, 46），P5はもう一つの小胞体ストレスセンサーIRE1の制御に寄与する47）という酸化還元酵素によるERストレスセンサーの制御が報告されており，小胞体の酸化還元環境が細胞全体の恒常性維持に密接に関わっていることが明らかになりつつある．
6. おわりに；今後の展望
PDIの発見以降，酸化的フォールディングの理解は飛躍的に進み，新生ポリペプチド鎖からPDI, Ero1そして分子状酸素へと直線的な電子伝達が示されてきた．しかし，近年，小胞体内腔での電子伝達は，硫黄原子を媒体としてネットワークを組み，複雑であることがわかってきた．このネットワーク形成が，小胞体内腔の恒常性に頑強性をもたらすものであり，また，より複雑なタンパク質高次構造体形成を可能にしているかもしれない．生体内の酸化的フォールディングをより理解するためには，小胞体での硫黄を媒体とした電子ネットワーク形成の解明が必須である．しかし，酸化的環境下での電子伝達がどのように効率よく成立するのかはいまだ不明である．また，細胞内にありながら，小胞体内腔がサイトゾルと比較して，どのように酸化的に維持されているのか，まったくわかっていない．超硫黄分子・修飾の実態が明らかにされ，これまで常識では考えられなかった電子伝達経路や，タンパク質構造形成が明らかにされるかもしれない．これら新たな知見が小胞体レドックス環境の実態解明につながることが大いに期待される．
引用文献
1) Xiao, W. & Loscalzo, J. (2020) Metabolic responses to reductive stress. Antioxid. Redox Signal., 32, 1330–1347.
2) Araki, K., Shun-ichiro, I., Kamiya, Y., Ron, D., Kato, K., Natsume, T., & Nagata, K. (2013) Ero1-α and PDIs constitute a hierarchical electron transfer network of endoplasmic reticulum oxidoreductases. J. Cell Biol., 202, 861–874.
3) Bilan, D.S. & Belousov, V.V. (2017) New tools for redox biology: From imaging to manipulation. Free Radic. Biol. Med., 109, 167–188.
4) Montero, D., Tachibana, C., Rahr Winther, J., & Appenzeller-Herzog, C. (2013) Intracellular glutathione pools are heterogeneously concentrated. Redox Biol., 1, 508–513.
5) Venetianer, P. & Straub, F.B. (1963) The enzymic reactivation of reduced ribonuclease. Biochim. Biophys. Acta, 67, 166–168.
6) Goldberger, R.F., Epstein, C.J., & Anfinsen, C.B. (1963) Acceleration of reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by a microsomal system from rat liver. J. Biol. Chem., 238, 628–635.
7) Freedman, R.B. (1984) Native disulphide bond formation in protein biosynthesis: Evidence for the role of protein disulphide isomerase. Trends Biochem. Sci., 9, 438–441.
8) Weissman, J.S. & Kimt, P.S. (1993) Efficient catalysis of disulphide bond rearrangements by protein disulphide isomerase. Nature, 365, 185–188.
9) Helenius, A., Marquardt, T., & Braakman, I. (1992) The endoplasmic reticulum as a protein-folding compartment. Trends Cell Biol., 2, 227–231.
10) Pollard, M.G., Travers, K.J., & Weissman, J.S. (1998) Ero1p: A novel and ubiquitous protein with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell, 1, 171–182.
11) Frand, A.R. & Kaiser, C.A. (1998) The ERO1 gene of yeast is required for oxidation of protein dithiols in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell, 1, 161–170.
12) Frand, A.R. & Kaiser, C.A. (1999) Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell, 4, 469–477.
13) Cabibbo, A., Pagani, M., Fabbri, M., Rocchi, M., Farmery, M.R., Bulleid, N.J., & Sitia, R. (2000) ERO1-L, a human protein that favors disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 275, 4827–4833.
14) Pagani, M., Fabbri, M., Benedetti, C., Fassio, A., Pilati, S., Bulleid, N.J., Cabibbo, A., & Sitia, R. (2000) Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-Lβ (ERO1-Lβ), a human gene induced in the course of the unfolded protein response. J. Biol. Chem., 275, 23685–23692.
15) Inaba, K., Masui, S., Iida, H., Vavassori, S., Sitia, R., & Suzuki, M. (2010) Crystal structures of human Ero1α reveal the mechanisms of regulated and targeted oxidation of PDI. EMBO J., 29, 3330–3343.
16) Iwawaki, T., Akai, R., Kohno, K., & Miura, M. (2004) A transgenic mouse model for monitoring endoplasmic reticulum stress. Nat. Med., 10, 98–102.
17) Zito, E., Chin, K., Blais, J., Harding, H.P., & Ron, D. (2010) ERO1-β, a pancreas-specific disulfide oxidase, promotes insulin biogenesis and glucose homeostasis. J. Cell Biol., 188, 821–832.
18) Wu, R.-F., Ma, Z., Liu, Z., & Terada, L.S. (2010) Nox4-derived H2O2 mediates endoplasmic reticulum signaling through local ras activation. Mol. Cell. Biol., 30, 3553–3568.
19) Zito, E., Melo, E.P., Yang, Y., Wahlander, Å., Neubert, T.A., & Ron, D. (2010) Oxidative protein folding by an endoplasmic reticulum-localized peroxiredoxin. Mol. Cell, 40, 787–797.
20) Iuchi, Y., Okada, F., Tsunoda, S., Kibe, N., Shirasawa, N., Ikawa, M., Okabe, M., Ikeda, Y., & Fujii, J. (2009) Peroxiredoxin 4 knockout results in elevated spermatogenic cell death via oxidative stress. Biochem. J., 419, 149–158.
21) Zito, E., Hansen, H.G., Yeo, G.S.H., Fujii, J., & Ron, D. (2012) Endoplasmic reticulum thiol oxidase deficiency leads to ascorbic acid depletion and noncanonical scurvy in mice. Mol. Cell, 48, 39–51.
22) Kanemura, S., Sofia, E.F., Hirai, N., Okumura, M., Kadokura, H., & Inaba, K. (2020) Characterization of the endoplasmic reticulum–resident peroxidases GPx7 and GPx8 shows the higher oxidative activity of GPx7 and its linkage to oxidative protein folding. J. Biol. Chem., 295, 12772–12785.
23) Takac, I., Schröder, K., Zhang, L., Lardy, B., Anilkumar, N., Lambeth, J.D., Shah, A.M., Morel, F., & Brandes, R.P. (2011) The E-loop is involved in hydrogen peroxide formation by the NADPH oxidase Nox4. J. Biol. Chem., 286, 13304–13313.
24) Janiszewski, M., Lopes, L.R., Carmo, A.O., Pedro, M.A., Brandes, R.P., Santos, C.X., & Laurindo, F.R. (2005) Regulation of NAD(P)H oxidase by associated protein disulfide isomerase in vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem., 280, 40813–40819.
25) Sato, Y., Kojima, R., Okumura, M., Hagiwara, M., Masui, S., Maegawa, K., Saiki, M., Horibe, T., Suzuki, M., & Inaba, K. (2013) Synergistic cooperation of PDI family members in peroxiredoxin 4-driven oxidative protein folding. Sci. Rep., 3, 2456.
26) Kodali, V.K. & Thorpe, C. (2010) Oxidative protein folding and the quiescin-sulfhydryl oxidase family of flavoproteins. Antioxid. Redox Signal., 13, 1217–1230.
27) Riemer, J., Appenzeller-Herzog, C., Johansson, L., Bodenmiller, B., Hartmann-Petersen, R., & Ellgaard, L. (2009) A luminal flavoprotein in endoplasmic reticulum-associated degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 14831–14836.
28) Schulte, L., Mao, J., Reitz, J., Sreeramulu, S., Kudlinzki, D., Hodirnau, V.V., Meier-Credo, J., Saxena, K., Buhr, F., Langer, J.D., et al. (2020) Cysteine oxidation and disulfide formation in the ribosomal exit tunnel. Nat. Commun., 11, 1–11.
29) Hirayama, C., Machida, K., Noi, K., Murakawa, T., Okumura, M., Ogura, T., Imataka, H., & Inaba, K. (2021) Distinct roles and actions of protein disulfide isomerase family enzymes in catalysis of nascent-chain disulfide bond formation. iScience, 24, 102296.
30) Araki, K. & Nagata, K. (2012) Protein folding and quality control in the ER. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 4, 1–25.
31) Anelli, T., Alessio, M., Mezghrani, A., Simmen, T., Talamo, F., Bachi, A., & Sitia, R. (2002) ERp44, a novel endoplasmic reticulum folding assistant of the thioredoxin family. EMBO J., 21, 835–844.
32) Kakihana, T., Araki, K., Vavassori, S., Iemura, S., Cortini, M., Fagioli, C., Natsume, T., Sitia, R., & Nagata, K. (2013) Dynamic regulation of Ero1α and peroxiredoxin 4 localization in the secretory pathway. J. Biol. Chem., 288, 29586–29594.
33) Vavassori, S., Cortini, M., Masui, S., Sannino, S., Anelli, T., Caserta, I.R., Fagioli, C., Mossuto, M.F., Fornili, A., van Anken, E., et al. (2013) A pH-regulated quality control cycle for surveillance of secretory protein assembly. Mol. Cell, 50, 783–792.
34) Cortini, M. & Sitia, R. (2010) From antibodies to adiponectin: Role of ERp44 in sizingand timing protein secretion. Diabetes Obes. Metab., 12(Suppl 2), 39–47.
35) Hisatsune, C., Ebisui, E., Usui, M., Ogawa, N., Suzuki, A., Mataga, N., Takahashi-Iwanaga, H., & Mikoshiba, K. (2015) ERp44 exerts redox-dependent control of blood pressure at the ER article ERp44 exerts redox-dependent control of blood pressure at the ER. Mol. Cell, 58, 1015–1027.
36) Nørgaard, P., Westphal, V., Tachibana, C., Alsøe, L., Holst, B., & Winther, J.R. (2001) Functional differences in yeast protein disulfide isomerases. J. Cell Biol., 153, 553–562.
37) Wang, Y., Nizkorodov, A., Riemenschneider, K., Lee, C.S., Olivares-Navarrete, R., Schwartz, Z., & Boyan, B.D. (2014) Impaired bone formation in pdia3 deficient mice. PLoS One, 9, 1–11.
38) Hosoda, A., Tokuda, M., Akai, R., Kohno, K., & Iwawaki, T. (2010) Positive contribution of ERdj5/JPDI to endoplasmic reticulum protein quality control in the salivary gland. Biochem. J., 425, 117–125.
39) Jessop, C.E., Watkins, R.H., Simmons, J.J., Tasab, M., & Bulleid, N.J. (2009) Protein disulphide isomerase family members show distinct substrate specificity: P5 is targeted to BiP client proteins. J. Cell Sci., 122, 4287–4295.
40) Brigelius-Flohé, R. & Flohé, L. (2011) Basic principles and emerging concepts in the redox control of transcription factors. Antioxid. Redox Signal., 15, 2335–2381.
41) Li, Y. & Camacho, P. (2004) Ca2+-dependent redox modulation of SERCA 2b by ERp57. J. Cell Biol., 164, 35–46.
42) Higo, T., Hattori, M., Nakamura, T., Natsume, T., Michikawa, T., & Mikoshiba, K. (2005) Subtype-specific and ER lumenal environment-dependent regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor Type 1 by ERp44. Cell, 120, 85–98.
43) Ushioda, R., Miyamoto, A., Inoue, M., Watanabe, S., Okumura, M., Maegawa, K.I., Uegaki, K., Fujii, S., Fukuda, Y., Umitsu, M., et al. (2016) Redox-assisted regulation of Ca2+ homeostasis in the endoplasmic reticulum by disulfide reductase ERdj5. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, E6055–E6063.
44) 潮田亮（2020）レドックス制御による小胞体恒常性維持機構の解明～還元反応の場としての小胞体～．生化学，92, 536–546.
45) Higa, A., Taouji, S., Lhomond, S., Jensen, D., Fernandez-Zapico, M.E., Simpson, J.C., Pasquet, J.M., Schekman, R., & Chevet, E. (2014) Endoplasmic reticulum stress-activated transcription factor ATF6 requires the disulfide isomerase PDIA5 to modulate chemoresistance. Mol. Cell. Biol., 34, 1839–1849.
46) Oka, O.B., Lith, M., Rudolf, J., Tungkum, W., Pringle, M.A., & Bulleid, N.J. (2019) ERp18 regulates activation of ATF6α during unfolded protein response. EMBO J., 38, 1–18.
47) Eletto, D., Eletto, D., Dersh, D., Gidalevitz, T., & Argon, Y. (2014) Protein disulfide isomerase A6 controls the decay of IRE1α signaling via disulfide-dependent association. Mol. Cell, 53, 562–576.
著者紹介
京都産業大学生命科学部先端生命科学科・タンパク質動態研究所准教授．博士（理学）．
略歴1980年神奈川県に生る．2009年京都大学大学院理学研究科生物物理専攻博士後期課程修了．09年より京都大学再生医科学研究所特別研究員，10年より日本学術振興会特別研究員（PD），10年10月より京都産業大学プロジェクト助教，研究助教を経て，19年より現職．
研究テーマと抱負小胞体内腔恒常性を維持するための小胞体環境の構築メカニズムに興味を持っています．是非，研究室Twitter（@Ushioda_Lab）で研究室の最新情報をフォローください．
ウェブサイトhttps://ushioda-lab.com/
活性酸素種と抗酸化酵素
生体内にはスーパーオキシドを酸素と過酸化水素に不均化する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（SOD：superoxide dismutase）が存在し、活性酸素種の最上流であるスーパーオキシドを式１、２のように不均化します。
M(n+1)+—SOD + O2•- → Mn+—SOD + O2 （式１）
Mn+—SOD + O2•- + 2H+ → M(n+1)+—SOD + H2O2 （式２）
Mは活性中心のMetalを表し、Cu (n=1), Mn (n=2) ヒトSODにはSOD1（Cu,Zn-SOD）、SOD2（Mn-SOD）、SOD3（EC-SOD：extracellular SOD）の３つのアイソフォームがあり、ミトコンドリアのマトリックスに存在するSOD2のノックアウトマウスは胎生致死であることより、ミトコンドリアで発生するスーパーオキシドを消去することは生命維持に不可欠であることがわかります。
スーパーオキシドが一電子還元された過酸化水素は、不対電子を持たないのでフリーラジカルではありませんが、活性酸素種のひとつです。SODがスーパーオキシドを不均化した際に生じます。また、グルコースオキシダーゼなどによって酸素分子から二電子還元によっても生成されます。過酸化水素はミトコンドリア内膜、外膜など細胞膜を通過できるので、細胞内の鉄などの遷移金属と反応すると、式３のように一電子還元され、ヒドロキシラジカルを生じます。
H2O2 + Fe2+ → •OH + OH- + Fe3+ （式３）
式３の反応はフェントン反応と呼ばれ、生体内で生じるほとんどのヒドロキシラジカルは、この反応で生じると考えられています。また、式４のハーバー・ワイス反応のように過酸化水素はスーパーオキシドとの反応でもヒドロキシラジカルが生じます。
H2O2 + O2•- → •OH + OH- + O2 （式４）
ヒドロキシラジカルは活性酸素種の中でも非常に反応性が高く、タンパク質や脂質、糖質、核酸などの生体成分を酸化します。従って、ヒドロキシラジカルの前駆体である過酸化水素を消去することは重要です。生体内にはグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオンリダクターゼや、ペルオキシレドキシン／チオレドキシン／チオレドキシンリダクターゼ、カタラーゼなどの過酸化水素を還元する抗酸化機構があり、これらの酵素反応によって水へと還元されます。
酸素原子はL殻に２個の不対電子を持っており、酸素分子を形成する際にそのうちのひとつの不対電子が互いに結合に用いられるので、合計２個の不対電子を持つ分子構造をとり、ビラジカルとよばれます。通常、酸素分子にある２個の不対電子のスピンは、三重項酸素(3O2)という比較的安定な基底状態で存在しています。リボフラビンやポルフィリン、抗生物質や抗炎症薬など光増感剤として働く可能性がある物質の存在下で、光反応により励起状態となり、２個の不対電子のスピンが逆向きになり、一重項酸素(Σ1O2)になります。逆スピンをもつ２個の不対電子は非常に不安定なので、同一軌道上に遷移し、一方の電子軌道が空になります(Δ1O2)。Δ1O2の方が安定なため、通常一重項酸素はΔ状態をさします。空になった電子軌道が電子を求めることにより、一重項酸素は強い酸化力を持ち、不飽和脂肪酸のような二重結合を有する化合物を酸化して脂質ヒドロペルオキシドを生成します。また、ポルフィリン症患者では日光に強く当たると一重項酸素により皮膚障害が起きることも報告されています。
れ血管内皮細胞と腸上皮細胞が存在している．創傷治癒に
必要な血管新生や消化管粘膜の修復は，これらの細胞の移
動，すなわち「細胞遊走」に依存する．近年，活性酸素産
生をはじめとした生体レドックス（酸化還元）反応は，細
胞遊走が関わる疾患，たとえば，がんや糖尿病性網膜症，
虚血性疾患などで注目されているが，その実態は不明な
点が多い．最近，我々は活性酸素生成酵素NADPHオキシ
ダーゼ（NADPH oxidase：NOX）が内皮・上皮細胞遊走を
制御していることを見いだした．本稿では，NOXの生理
的役割やNOXによる細胞遊走制御機構について，我々の
最新の知見をもとに概説する．
2. 活性酸素生成酵素NOXとその生理的役割
NOXは，活性酸素の一種であるスーパーオキシド（O2
−）
や過酸化水素（H2O2）を生成する酵素である1）．ヒトでは
NOX1～NOX5の5種類と，DUOX1（Dual oxidase 1）およ
びDUOX2の2種が存在し，ファミリーを形成している．
NOXファミリーの中で最もよく知られているのが，好中
球やマクロファージなどの食細胞に発現するNOX2であ
る2）．食細胞NOX2から生成されたO2
−は，H2O2や次亜塩
素酸へと派生し，強力な殺菌剤として機能する．NOX2の
重要性は，その遺伝的欠損が幼少期より重篤な感染症を繰
り返す慢性肉芽腫症を引き起こすことから明らかである．
長らくNADPHオキシダーゼとしては，食細胞gp91phoxが
知られていたが，1999年に新たにNOX1が同定された3）．
プロトタイプのgp91phoxは，NOX2とリネームされた．その
後，次々と他のホモログが同定され，遺伝子改変マウスの
解析により，それらの機能の遺伝的な証拠が提示されてき
た．NOX1は，消化管において局所における感染制御4）や
腸管粘膜の維持5, 6）に関わっていることが指摘された．ま
た，NOX3から生成されたO2
−は，内耳において平衡感覚に
必須の耳石の形成に使用されていることが示され，NOX4
は，後肢虚血モデルマウスにおいて，創傷治癒に関わる血
管新生を促進することが明らかにされた．その一方NOX5
は，げっ歯類には存在しないため，その機能の遺伝的証拠
は乏しい．
NOX1とNOX4は，それぞれ消化管上皮細胞と血管内皮
細胞に豊富に発現している．そもそもこれらの細胞は腸管
と血管の裏打ちとして存在しているが，消化管粘膜の修復
や創傷治癒に必要な血管新生は，いずれも上皮・内皮細胞
の移動＝“細胞遊走”に依存している．以前より，細胞遊走
とレドックス反応の関係は指摘されているものの，その詳
細なメカニズムは未解明であるため，我々はNOXこそが
このレドックス反応を引き起こす活性酸素の生成源として
機能しているのではないかと考えた．
3. 細胞動態測定装置（TAXIScan）による細胞遊走能
の解析
TAXIScanは，遊走能を有する細胞が，走化性因子に向
かって水平方向に移動するようすをリアルタイムで観察
できる装置であり，金ヶ﨑らにより開発された（図1A）7）．
遊走能の指標として，走化性因子に対する細胞遊走の “方
向性”と “速さ”が計測できる．血管内皮細胞の走化性因子
としては，血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth
factor A：VEGF-A）が知られ，実際にヒト臍帯静脈内皮
細胞から樹立された細胞培養株EA.hy926細胞は，VEGFAの濃度勾配の存在により “方向性”と “速さ”においてと
もに増加する（図1B）8）．我々はこのTAXIScanを用いて，
NOX4の内皮細胞遊走への関与を調べるために，RNA干
渉法によるEA.hy926細胞のNOX4のノックダウンを行っ
た8）．NOX4ノックダウン細胞は，コントロール細胞と比
べて，VEGF-Aに向かっての遊走能が低下していた（図
1B）．これは，NOX4依存性のレドックス反応が内皮細胞
遊走を促進していることを示している．
続いて，我々は大腸上皮細胞株としてNOX1を発現して
いることが知られるヒト結腸腺がん細胞（HCT-116細胞）
の細胞遊走能を測定した（走化性因子は，ウシ胎仔血清
を用いた）．するとNOX4とは対照的に，NOX1のノック
112
みにれびゅう
113
生化学 第 94 巻第 1 号（2022）
ダウンは，HCT-116細胞の遊走能を増加させた（図1C）9）．
内皮と上皮という細胞の違いはあるものの，興味深いこと
に，NOX4が細胞遊走を促進するのに対して，NOX1は遊
走を抑制しているようである．つまり，NOXから生成さ
れた活性酸素がそれぞれ特異的な細胞遊走シグナルに作用
しているのではないだろうか．
4. NOX4による血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）
の表面局在の維持
内皮細胞は，細胞外VEGF-Aの濃度勾配を細胞表面受
容体である血管内皮増殖因子受容体2（vascular endothelial
growth factor receptor-2：VEGFR-2）により検知する（図
2A）．以前より，VEGF-A/VEGFR-2シグナル伝達に依存的
な血管新生には，レドックス反応が関わることが指摘さ
れていた10）．我々は血管新生に必須の内皮細胞遊走には，
VEGF-A/VEGFR-2シグナル伝達が必要であること11），そ
の遊走能をNOX4が正に制御していることから（図1B），
NOX4‒レドックス反応系とVEGFR-2に関連性があるので
はないかと考えた．実際に，NOX4のノックダウンにより
細胞表面のVEGFR-2局在量は減少している（図2B）．こ
の結果が示唆するのは，NOX4がVEGFR-2の細胞表面発
現量を維持することにより細胞遊走を促進していることで
ある．
膜タンパク質であるVEGFR-2は，細胞小器官の小胞体
で翻訳後修飾を含むタンパク質フォールディングを受け，
フォールディングされたVEGFR-2は，ゴルジ体を経由し
て細胞表面へ輸送される．細胞表面VEGFR-2は，細胞外
VEGF-Aと結合すると，その複合体は細胞内部移行を起
こし，遊走シグナル伝達を開始すると同時に，シグナル
伝達が過剰に続かないようにするために速やかに分解さ
れる．実際に小胞体からの細胞表面へのタンパク質輸送
を輸送阻害剤ブレフェルジンA（BFA）で抑制すると，小
胞体から新たなVEGFR-2が輸送されないために細胞表面
VEGFR-2は速やかに分解され，細胞表面VEGFR-2量は減
少する（図2C）．すなわち，細胞遊走を制御するVEGF-A/
VEGFR-2シグナル伝達を維持するためには，絶えず小胞
体から細胞表面へとVEGFR-2が連続して供給されること
が必要不可欠なのである．
他のNOXファミリーが積極的に細胞表面へ輸送されて
細胞外へO2
−を生成するのとは異なり，NOX4は小胞体に
局在し，小胞体内腔にH2O2を生成していると考えられて
いる1）．これは，NOX4が小胞体に局在するVEGFR-2（輸
送される前のVEGFR-2）に，何らかの影響を（たとえば，
タンパク質レベルでの安定化）与えているのではないか
と想像させる．新規のタンパク質合成をシクロヘキシミ
ド（CHX）処理により阻害すると，不安定なタンパク質
図1 TAXIScanによる内皮・上皮細胞遊走解析
（A） TAXIScanの原理．スライドガラスとチップで対象細胞が
遊走する空間を形成する．A側に細胞をアプライし，B側に走
化性因子をアプライする．拡散により形成される走化性因子
の濃度勾配に従って，細胞が遊走するようすをカメラで撮影
する．定間隔での細胞軌道パターンを解析し，速さ（単位時間
あたりの距離）および方向性（スタートラインに対する移動角
度；radian）を求める．（B） NOX4による内皮細胞遊走促進と，
（C） NOX1による上皮細胞遊走抑制．走化性因子としてVEGFA（B）およびウシ胎仔血清（C）を用いた．内皮細胞（EA.hy926
細胞）および上皮細胞（HCT-116細胞）へsiRNAをリポフェク
ションし，NOXのノックダウンを行った（文献8, 9より改変）．
114
生化学 第 94 巻第 1 号（2022）
ほど速やかに分解されていく過程を観察することが可能で
ある．我々はNOX4をノックダウンした細胞またはコント
ロール細胞をCHXで処理し，残存するVEGFR-2の量を免
疫ブロットにより確認（図2D）したところ，コントロー
ルの細胞では，新規VEGFR-2の合成を阻害しても，十分
な量の小胞体局在型VEGFR-2を検出することができた．
一方，NOX4をノックダウンした細胞では，コントロール
細胞に比べて，小胞体局在VEGFR-2の分解が促進されて
いた（図2D）．この結果は，NOX4のノックダウンにより
小胞体VEGFR-2が不安定になっていることを示唆してい
る．NOX4による小胞体VEGFR-2の安定化のメカニズム
は不明ではあるが，NOX4由来のH2O2は，レドックス反応
により制御を受ける小胞体の恒常性に関わるタンパク質に
作用し，結果的に小胞体VEGFR-2の安定性を維持できる
環境形成に寄与しているのかもしれない（図2E）．
5. NOX1によるヒト結腸腺がん細胞遊走の抑制：NOX1
活性の正のフィードバック調節
NOXファミリーの中でも，食細胞NOX2の酵素活性は
厳密に制御されている1）．NOX2は，細胞刺激依存性（す
なわち，病原体の貪食時に発生するシグナル依存性）に特
異的な細胞質タンパク質因子p67phoxとp47phoxおよび低分子
量Gタンパク質Racとタンパク質複合体を形成することに
より，初めて活性化される（図3A）．他方，NOX4は，単
独でH2O2を生成することから（図3A），酵素活性の調節
図2 NOX4による細胞表面VEGFR-2量の維持
（A） VEGF-A/VEGFR-2シグナルによる内皮細胞遊走．内皮細胞は，VEGFの濃度勾配に従って遊走し，血管を伸
長する（血管新生）．（B） NOX4のノックダウン（KD）によるVEGFR-2発現量の低下．内皮細胞（EA.hy926細
胞）のNOX4をノックダウンし，細胞ライゼートを回収し，免疫ブロットによりVEGFR-2タンパク質を検出した．
β-tubulinをローディング・コントロールとしてブロットした．図中の “shorter exposure”および “longer exposure”は，
X線フィルムへの露光時間の長さを示す．VEGFR-2は，200 kDa付近にバンドが2本出現する．上方のバンドは，
細胞表面局在型（複合型糖鎖を持つ）であり，下方のバンドは，小胞体局在型（高マンノース型糖鎖を持つ）の
VEGFR-2タンパク質である．NOX4のノックダウンにより細胞表面局在型および小胞体局在型VEGFR-2がともに
減少していた．（C）タンパク質輸送の阻害によるVEGFR-2細胞表面局在量の減少．細胞内輸送経路（小胞体からゴ
ルジ体へ）をブレフェルジンAで阻害すると，3時間でほとんどの細胞表面型VEGFR-2が消失した．これは，細胞
表面局在VEGFR-2の維持のためには，細胞表面へ絶え間なく小胞体型VEGFR-2が輸送される必要があることを示
す．（D） NOX4による小胞体局在VEGFR-2のタンパク質レベルでの安定化．内皮細胞（EA.hy926細胞）のNOX4
をノックダウンし，その後，新規のタンパク質生合成をシクロヘキシミドで処理することで阻害し，図に示した時
間に細胞ライゼートを回収し，免疫ブロットによりVEGFR-2タンパク質を検出した．シクロヘキシミド処理前に，
ブレフェルジンAで前処理し，すべてのVEGFR-2を小胞体にとどめている（細胞表面型VEGFR-2は，すべて分解
されており，存在しない）．NOX4のノックダウンにより小胞体局在型VEGFR-2は，7.5時間で著しい分解が認めら
れた．（E） NOX4による内皮細胞遊走の促進．NOX4は，小胞体でVEGFR-2を安定化する．その機構の詳細は不明
であるが，この安定化が細胞表面VEGFR-2の局在維持に寄与することで，VEGFの濃度勾配に従って内皮細胞は遊
走する（文献8より改変）．
115
生化学 第 94 巻第 1 号（2022）
は受けず，転写レベルでのNOX4タンパク質の発現調節
により，供給するH2O2の量を制御していると考えられる．
NOX2と同様に，NOX1活性は，特異的な細胞質タンパク
質因子NOXA1とNOXO1を必要とするが，細胞刺激に非
依存性に常時タンパク質複合体を形成し，細胞外に恒常的
にO2
−を生成している（図3A）．
最近我々は，NOX1を発現する細胞をフリーラジカル
スカベンジャー化合物で24時間処理すると，化合物の洗
い出し後もNOX1活性が減弱されていることを見いだし
た9）．これは，NOX1活性が，自身の生成物（O2
−）により
正のフィードバック調節を受けていることを示唆する．以
前，NOX1由来のO2
−がSrcキナーゼシグナル伝達経路を介
してNOX1自身のmRNAレベルの上方制御を促進する正
のフィードバックループが示されたことがある12）．しか
し，我々の観察では，フリーラジカルスカベンジャー化合
物処理後（すなわち，NOX1活性が低下している状態）に
おいては細胞表面のNOX1局在量の低下は認められず，ま
た，NOXO1とNOXA1との複合体形成にも影響がみられ
なかった．したがって，転写レベルでの正のフィードバッ
ク調節に加えて，未知のレドックス反応経路による活性制
御システムが存在しているのではないだろうか．
NOX1のノックダウンが，ヒト結腸腺がんHCT-116細胞
の遊走能を増加させることから（図1C），上皮細胞遊走シ
グナルは，NOX1活性により調節されると考えられる．実
際，フリーラジカルスカベンジャー化合物での前処理によ
るNOX1活性のフィードバックループの阻害は，NOX1活
性の低下に伴って，上皮細胞遊走を促進させた9）．これら
の結果が示唆するのは，フィードバックループで調節され
るNOX1活性により粘膜損傷の修復における重要な過程で
ある上皮細胞の遊走能を制御していることである．
NOX1活性による上皮細胞遊走の抑制は，細胞未刺激の
状態で見いだされた現象である．遊離アラキドン酸による
細胞刺激時には，反対にNOX1は上皮細胞遊走を促進する
ことが報告されている6）．これは，細胞未刺激と細胞刺激
時で，NOX1が異なるレドックス反応経路を用いて細胞遊
走の抑制・促進に関与していることを示唆する．未刺激細
図3 NOX1活性化機構と上皮細胞遊走
（A） NOX1, NOX2, NOX4の活性化機構．膜タンパク質であるNOX1, NOX2, NOX4は，同じく膜タンパク質でパー
トナー分子であるp22phoxと複合体を形成している．NOX1は，細胞質タンパク質因子であるNOXA1とNOXO1, そ
して低分子量Gタンパク質Racと細胞刺激非依存性に複合体を形成し，O2
−を生成する．またNOX2は，細胞質に存
在する活性化タンパク質因子p67phox，p47phoxおよびRacが細胞刺激に応じて（病原体の貪食時）膜移行すると，そ
れらと複合体を形成することによって初めてO2
−を生成する．一方，NOX4は恒常的に単独でH2O2を生成している．
（B） NOX1による上皮細胞遊走の促進と抑制．NOX1は，細胞未刺激と細胞刺激時に上皮細胞遊走をそれぞれ抑
制・促進しているが，その分子メカニズムは不明なままである．
116
生化学 第 94 巻第 1 号（2022）
胞においては，NOX1は正常な消化管構造の機能と整合性
を保つために無秩序な細胞遊走を抑制し，一方，粘膜損傷
時，すなわち細胞刺激時にはNOX1による遊走促進へと切
り替え，速やかに損傷部位の修復にあたると考えられる
（図3B）．
6. おわりに
NOX4の生理的な役割（創傷治癒時の血管新生を促進す
る）に対して，NOX4の過剰発現とそれに伴うレドックス
反応の増強は，“望ましくない”血管新生と関連しており，
NOX4の病原性につながる13）．NOX4は，糖尿病性網膜
症14）および腫瘍発達15）に関係する血管新生を誘発するこ
とが報告されており，内皮細胞の遊走の促進が原因である
可能性が示唆されている．NOX4は生理的および病態的血
管新生の両方に関わっているのである．今後，NOX4のレ
ドックス標的分子の同定とVEGFR-2への作用機序を明ら
かにすることにより，NOX4‒VEGF-A/VEGFR-2シグナル
伝達を標的とした内皮細胞遊走制御が実現できれば，無秩
序な血管新生により引き起こされる疾患への新しい対処方
法の確立も期待できるだろう．一方，NOX1については，
その過剰な活性化と大腸がんの増悪との関連が指摘されて
いることなどを考えれば，興味深い課題として，NOX1活
性の正のフィードバック調節機構や，O2
−による細胞遊走
の促進・抑制の切り替え機構の解明が今後求められるだろ
う．
NOXファミリーが定義されて20年ほどを経た現在も，
その真の理解のためには課題が山積しているが，それは
NOXの生理機能が多岐にわたりクロストークしているさ
まが次々と明らかになってくるからである．だからこそ魅
力的な研究対象であると同時に，生体にとっては重要なも
のとして，上記のような生化学研究がNOXの生理機能の
全容解明へ至る一助となることを期待するものである．
謝辞
本稿で紹介した筆者らの研究は，主に川崎医科大学生
化学教室（栗林太教授）で行われたものであり，共同研究
を行った岡本秀一郎講師，ならびに川井千景様（研究補助
員）に感謝いたします．また，その研究の一部は，科学研
究費補助金（課題番号17K08637），公益財団法人ウエスコ
学術振興財団，公益財団法人両備檉園記念財団，川崎医科
大学プロジェクト研究，および公益財団法人岡山医学振興
会などの支援を受けました．ここに感謝の意を表します．
文 献
1) Brandes, R.P., Weissmann, N., & Schröder, K. (2014) Nox family NADPH oxidases: Molecular mechanisms of activation. Free
Radic. Biol. Med., 76, 208‒226.
2) Nauseef, W.M. (2019) The phagocyte NOX2 NADPH oxidase
in microbial killing and cell signaling. Curr. Opin. Immunol., 60,
130‒140.
3) Suh, Y.A., Arnold, R.S., Lassegue, B., Shi, J., Xu, X., Sorescu,
D., Chung, A.B., Griendling, K.K., & Lambeth, J.D. (1999) Cell
transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1.
Nature, 401, 79‒82.
4) Rokutan, K., Kawahara, T., Kuwano, Y., Tominaga, K., Sekiyama, A., & Teshima-Kondo, S. (2006) NADPH oxidases in the
gastrointestinal tract: A potential role of Nox1 in innate immune
response and carcinogenesis. Antioxid. Redox Signal., 8, 1573‒
1582.
5) Sadok, A., Bourgarel-Rey, V., Gattacceca, F., Penel, C., Lehmann, M., & Kovacic, H. (2008) Nox1-dependent superoxide production controls colon adenocarcinoma cell migration. Biochim.
Biophys. Acta, 1783, 23‒33.
6) Kwon, J., Wang, A., Burke, D.J., Boudreau, H.E., Lekstrom, K.J.,
Korzeniowska, A., Sugamata, R., Kim, Y.S., Yi, L., Ersoy, I., et
al. (2016) Peroxiredoxin 6 (Prdx6) supports NADPH oxidase1
(Nox1)-based superoxide generation and cell migration. Free
Radic. Biol. Med., 96, 99‒115.
7) Kanegasaki, S., Nomura, Y., Nitta, N., Akiyama, S., Tamatani, T.,
Goshoh, Y., Yoshida, T., Sato, T., & Kikuchi, Y. (2003) A novel
optical assay system for the quantitative measurement of chemotaxis. J. Immunol. Methods, 282, 1‒11.
8) Miyano, K., Okamoto, S., Yamauchi, A., Kawai, C., Kajikawa,
M., Kiyohara, T., Tamura, M., Taura, M., & Kuribayashi, F.
(2020) The NADPH oxidase NOX4 promotes the directed
migration of endothelial cells by stabilizing vascular endothelial
growth factor receptor 2 protein. J. Biol. Chem., 295, 11877‒
11890.
9) Miyano, K., Okamoto, S., Yamauchi, A., Kajikawa, M., Kiyohara, T., Taura, M., Kawai, C., & Kuribayashi, F. (2020) Constitutive activity of NADPH oxidase 1 (Nox1) that promotes its
own activity suppresses the colon epithelial cell migration. Free
Radic. Res., 54, 640‒648.
10) Kim, Y.W. & Byzova, T.V. (2014) Oxidative stress in angiogenesis and vascular disease. Blood, 123, 625‒631.
11) Bernatchez, P.N., Soker, S., & Sirois, M.G. (1999) Vascular
endothelial growth factor effect on endothelial cell proliferation, migration, and platelet-activating factor synthesis is Flk1-dependent. J. Biol. Chem., 274, 31047‒31054.
12) Sancho, P. & Fabregat, I. (2010) NADPH oxidase NOX1 controls autocrine growth of liver tumor cells through up-regulation
of the epidermal growth factor receptor pathway. J. Biol. Chem.,
285, 24815‒24824.
13) Kuroda, J., Ago, T., Matsushima, S., Zhai, P., Schneider, M.D.,
& Sadoshima, J. (2010) NADPH oxidase 4 (Nox4) is a major
source of oxidative stress in the failing heart. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 107, 15565‒15570.
14) Vogel, J., Kruse, C., Zhang, M., & Schröder, K. (2015) Nox4
supports proper capillary growth in exercise and retina neovascularization. J. Physiol., 593, 2145‒2154.
15) Helfinger, V., Henke, N., Harenkamp, S., Walter, M., Epah, J.,
Penski, C., Mittelbronn, M., & Schröder, K. (2016) The NADPH
Oxidase Nox4 mediates tumour angiogenesis. Acta Physiol.
(Oxf.), 216, 435‒446.
117
生化学 第 94 巻第 1 号（2022）
著者寸描
●宮野 佳（みやの けい）
川崎医科大学生化学教室助教．博士（工学）．
■略歴 2004年愛媛大学大学院理工学研究科博士後期課程修
了，学位（博士（工学））取得．04年から19年2月まで九州大
学医学研究院において博士研究員および助教．19年3月より現
職．
■研究テーマと抱負 NOXが司るレドックス反応機構を明ら
かにしたい．
■趣味 お料理，海外旅行（現地のレシピブックを購入するた
め）．
●山内 明（やまうち あきら）
川崎医科大学生化学教室教授．産学連携知的財産管理室室長．
博士（医学）．
■略歴 1970年長崎県生まれ．95年長崎大学医学部卒業．
2001年同大学院医学研究科（熱帯医学研究所感染生化学）博士
課程修了．99～2003年米国インディアナ大学小児科ポスドク．
03年東京大学先端科学技術研究センター特任助手および株式会
社ECI主任研究員．10年川崎医科大学生化学教室准教授．15～
16年英国オックスフォード大学フェローを経て16年より現職．
■研究テーマと抱負 細胞機能（活性酸素産生，走化性等）の
解析を通じて，生体防御，がん，炎症，感染症の制御を目指し
ている．
■ウェブサイト https://m.kawasaki-m.ac.jp/classroom/course.
php?id=2
活性酸素生成酵素NOXによる細胞遊走の制御機構
川崎医科大学生化学教室 ◇ 〒701–0192 岡山県倉敷市松島577
© 2022 公益社団法人日本生化学会
1. はじめに
生体の管状構造物である血管や腸管の内側には，それぞれ血管内皮細胞と腸上皮細胞が存在している．創傷治癒に必要な血管新生や消化管粘膜の修復は，これらの細胞の移動，すなわち「細胞遊走」に依存する．近年，活性酸素産生をはじめとした生体レドックス（酸化還元）反応は，細胞遊走が関わる疾患，たとえば，がんや糖尿病性網膜症，虚血性疾患などで注目されているが，その実態は不明な点が多い．最近，我々は活性酸素生成酵素NADPHオキシダーゼ（NADPH oxidase：NOX）が内皮・上皮細胞遊走を制御していることを見いだした．本稿では，NOXの生理的役割やNOXによる細胞遊走制御機構について，我々の最新の知見をもとに概説する．
2. 活性酸素生成酵素NOXとその生理的役割
NOXは，活性酸素の一種であるスーパーオキシド（O2−）や過酸化水素（H2O2）を生成する酵素である1）．ヒトではNOX1～NOX5の5種類と，DUOX1（Dual oxidase 1）およびDUOX2の2種が存在し，ファミリーを形成している．NOXファミリーの中で最もよく知られているのが，好中球やマクロファージなどの食細胞に発現するNOX2である2）．食細胞NOX2から生成されたO2−は，H2O2や次亜塩素酸へと派生し，強力な殺菌剤として機能する．NOX2の重要性は，その遺伝的欠損が幼少期より重篤な感染症を繰り返す慢性肉芽腫症を引き起こすことから明らかである．
長らくNADPHオキシダーゼとしては，食細胞gp91phoxが知られていたが，1999年に新たにNOX1が同定された3）．プロトタイプのgp91phoxは，NOX2とリネームされた．その後，次々と他のホモログが同定され，遺伝子改変マウスの解析により，それらの機能の遺伝的な証拠が提示されてきた．NOX1は，消化管において局所における感染制御4）や腸管粘膜の維持5, 6）に関わっていることが指摘された．また，NOX3から生成されたO2−は，内耳において平衡感覚に必須の耳石の形成に使用されていることが示され，NOX4は，後肢虚血モデルマウスにおいて，創傷治癒に関わる血管新生を促進することが明らかにされた．その一方NOX5は，げっ歯類には存在しないため，その機能の遺伝的証拠は乏しい．
NOX1とNOX4は，それぞれ消化管上皮細胞と血管内皮細胞に豊富に発現している．そもそもこれらの細胞は腸管と血管の裏打ちとして存在しているが，消化管粘膜の修復や創傷治癒に必要な血管新生は，いずれも上皮・内皮細胞の移動＝“細胞遊走”に依存している．以前より，細胞遊走とレドックス反応の関係は指摘されているものの，その詳細なメカニズムは未解明であるため，我々はNOXこそがこのレドックス反応を引き起こす活性酸素の生成源として機能しているのではないかと考えた．
3. 細胞動態測定装置（TAXIScan）による細胞遊走能の解析
TAXIScanは，遊走能を有する細胞が，走化性因子に向かって水平方向に移動するようすをリアルタイムで観察できる装置であり，金ヶ﨑らにより開発された（図1A）7）．遊走能の指標として，走化性因子に対する細胞遊走の“方向性”と“速さ”が計測できる．血管内皮細胞の走化性因子としては，血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor A：VEGF-A）が知られ，実際にヒト臍帯静脈内皮細胞から樹立された細胞培養株EA.hy926細胞は，VEGF-Aの濃度勾配の存在により“方向性”と“速さ”においてともに増加する（図1B）8）．我々はこのTAXIScanを用いて，NOX4の内皮細胞遊走への関与を調べるために，RNA干渉法によるEA.hy926細胞のNOX4のノックダウンを行った8）．NOX4ノックダウン細胞は，コントロール細胞と比べて，VEGF-Aに向かっての遊走能が低下していた（図1B）．これは，NOX4依存性のレドックス反応が内皮細胞遊走を促進していることを示している．
図1 TAXIScanによる内皮・上皮細胞遊走解析
（A） TAXIScanの原理．スライドガラスとチップで対象細胞が遊走する空間を形成する．A側に細胞をアプライし，B側に走化性因子をアプライする．拡散により形成される走化性因子の濃度勾配に従って，細胞が遊走するようすをカメラで撮影する．定間隔での細胞軌道パターンを解析し，速さ（単位時間あたりの距離）および方向性（スタートラインに対する移動角度；radian）を求める．（B） NOX4による内皮細胞遊走促進と，（C） NOX1による上皮細胞遊走抑制．走化性因子としてVEGF-A（B）およびウシ胎仔血清（C）を用いた．内皮細胞（EA.hy926細胞）および上皮細胞（HCT-116細胞）へsiRNAをリポフェクションし，NOXのノックダウンを行った（文献8, 9より改変）．
続いて，我々は大腸上皮細胞株としてNOX1を発現していることが知られるヒト結腸腺がん細胞（HCT-116細胞）の細胞遊走能を測定した（走化性因子は，ウシ胎仔血清を用いた）．するとNOX4とは対照的に，NOX1のノックダウンは，HCT-116細胞の遊走能を増加させた（図1C）9）．内皮と上皮という細胞の違いはあるものの，興味深いことに，NOX4が細胞遊走を促進するのに対して，NOX1は遊走を抑制しているようである．つまり，NOXから生成された活性酸素がそれぞれ特異的な細胞遊走シグナルに作用しているのではないだろうか．
4. NOX4による血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2）の表面局在の維持
内皮細胞は，細胞外VEGF-Aの濃度勾配を細胞表面受容体である血管内皮増殖因子受容体2（vascular endothelial growth factor receptor-2：VEGFR-2）により検知する（図2A）．以前より，VEGF-A/VEGFR-2シグナル伝達に依存的な血管新生には，レドックス反応が関わることが指摘されていた10）．我々は血管新生に必須の内皮細胞遊走には，VEGF-A/VEGFR-2シグナル伝達が必要であること11），その遊走能をNOX4が正に制御していることから（図1B），NOX4–レドックス反応系とVEGFR-2に関連性があるのではないかと考えた．実際に，NOX4のノックダウンにより細胞表面のVEGFR-2局在量は減少している（図2B）．この結果が示唆するのは，NOX4がVEGFR-2の細胞表面発現量を維持することにより細胞遊走を促進していることである．
図2 NOX4による細胞表面VEGFR-2量の維持
（A） VEGF-A/VEGFR-2シグナルによる内皮細胞遊走．内皮細胞は，VEGFの濃度勾配に従って遊走し，血管を伸長する（血管新生）．（B） NOX4のノックダウン（KD）によるVEGFR-2発現量の低下．内皮細胞（EA.hy926細胞）のNOX4をノックダウンし，細胞ライゼートを回収し，免疫ブロットによりVEGFR-2タンパク質を検出した．β-tubulinをローディング・コントロールとしてブロットした．図中の“shorter exposure”および“longer exposure”は，X線フィルムへの露光時間の長さを示す．VEGFR-2は，200 kDa付近にバンドが2本出現する．上方のバンドは，細胞表面局在型（複合型糖鎖を持つ）であり，下方のバンドは，小胞体局在型（高マンノース型糖鎖を持つ）のVEGFR-2タンパク質である．NOX4のノックダウンにより細胞表面局在型および小胞体局在型VEGFR-2がともに減少していた．（C）タンパク質輸送の阻害によるVEGFR-2細胞表面局在量の減少．細胞内輸送経路（小胞体からゴルジ体へ）をブレフェルジンAで阻害すると，3時間でほとんどの細胞表面型VEGFR-2が消失した．これは，細胞表面局在VEGFR-2の維持のためには，細胞表面へ絶え間なく小胞体型VEGFR-2が輸送される必要があることを示す．（D） NOX4による小胞体局在VEGFR-2のタンパク質レベルでの安定化．内皮細胞（EA.hy926細胞）のNOX4をノックダウンし，その後，新規のタンパク質生合成をシクロヘキシミドで処理することで阻害し，図に示した時間に細胞ライゼートを回収し，免疫ブロットによりVEGFR-2タンパク質を検出した．シクロヘキシミド処理前に，ブレフェルジンAで前処理し，すべてのVEGFR-2を小胞体にとどめている（細胞表面型VEGFR-2は，すべて分解されており，存在しない）．NOX4のノックダウンにより小胞体局在型VEGFR-2は，7.5時間で著しい分解が認められた．（E） NOX4による内皮細胞遊走の促進．NOX4は，小胞体でVEGFR-2を安定化する．その機構の詳細は不明であるが，この安定化が細胞表面VEGFR-2の局在維持に寄与することで，VEGFの濃度勾配に従って内皮細胞は遊走する（文献8より改変）．
膜タンパク質であるVEGFR-2は，細胞小器官の小胞体で翻訳後修飾を含むタンパク質フォールディングを受け，フォールディングされたVEGFR-2は，ゴルジ体を経由して細胞表面へ輸送される．細胞表面VEGFR-2は，細胞外VEGF-Aと結合すると，その複合体は細胞内部移行を起こし，遊走シグナル伝達を開始すると同時に，シグナル伝達が過剰に続かないようにするために速やかに分解される．実際に小胞体からの細胞表面へのタンパク質輸送を輸送阻害剤ブレフェルジンA（BFA）で抑制すると，小胞体から新たなVEGFR-2が輸送されないために細胞表面VEGFR-2は速やかに分解され，細胞表面VEGFR-2量は減少する（図2C）．すなわち，細胞遊走を制御するVEGF-A/VEGFR-2シグナル伝達を維持するためには，絶えず小胞体から細胞表面へとVEGFR-2が連続して供給されることが必要不可欠なのである．
他のNOXファミリーが積極的に細胞表面へ輸送されて細胞外へO2−を生成するのとは異なり，NOX4は小胞体に局在し，小胞体内腔にH2O2を生成していると考えられている1）．これは，NOX4が小胞体に局在するVEGFR-2（輸送される前のVEGFR-2）に，何らかの影響を（たとえば，タンパク質レベルでの安定化）与えているのではないかと想像させる．新規のタンパク質合成をシクロヘキシミド（CHX）処理により阻害すると，不安定なタンパク質ほど速やかに分解されていく過程を観察することが可能である．我々はNOX4をノックダウンした細胞またはコントロール細胞をCHXで処理し，残存するVEGFR-2の量を免疫ブロットにより確認（図2D）したところ，コントロールの細胞では，新規VEGFR-2の合成を阻害しても，十分な量の小胞体局在型VEGFR-2を検出することができた．一方，NOX4をノックダウンした細胞では，コントロール細胞に比べて，小胞体局在VEGFR-2の分解が促進されていた（図2D）．この結果は，NOX4のノックダウンにより小胞体VEGFR-2が不安定になっていることを示唆している．NOX4による小胞体VEGFR-2の安定化のメカニズムは不明ではあるが，NOX4由来のH2O2は，レドックス反応により制御を受ける小胞体の恒常性に関わるタンパク質に作用し，結果的に小胞体VEGFR-2の安定性を維持できる環境形成に寄与しているのかもしれない（図2E）．
5. NOX1によるヒト結腸腺がん細胞遊走の抑制：NOX1活性の正のフィードバック調節
NOXファミリーの中でも，食細胞NOX2の酵素活性は厳密に制御されている1）．NOX2は，細胞刺激依存性（すなわち，病原体の貪食時に発生するシグナル依存性）に特異的な細胞質タンパク質因子p67phoxとp47phoxおよび低分子量Gタンパク質Racとタンパク質複合体を形成することにより，初めて活性化される（図3A）．他方，NOX4は，単独でH2O2を生成することから（図3A），酵素活性の調節は受けず，転写レベルでのNOX4タンパク質の発現調節により，供給するH2O2の量を制御していると考えられる．NOX2と同様に，NOX1活性は，特異的な細胞質タンパク質因子NOXA1とNOXO1を必要とするが，細胞刺激に非依存性に常時タンパク質複合体を形成し，細胞外に恒常的にO2−を生成している（図3A）．
図3 NOX1活性化機構と上皮細胞遊走
（A） NOX1, NOX2, NOX4の活性化機構．膜タンパク質であるNOX1, NOX2, NOX4は，同じく膜タンパク質でパートナー分子であるp22phoxと複合体を形成している．NOX1は，細胞質タンパク質因子であるNOXA1とNOXO1, そして低分子量Gタンパク質Racと細胞刺激非依存性に複合体を形成し，O2−を生成する．またNOX2は，細胞質に存在する活性化タンパク質因子p67phox，p47phoxおよびRacが細胞刺激に応じて（病原体の貪食時）膜移行すると，それらと複合体を形成することによって初めてO2−を生成する．一方，NOX4は恒常的に単独でH2O2を生成している．（B） NOX1による上皮細胞遊走の促進と抑制．NOX1は，細胞未刺激と細胞刺激時に上皮細胞遊走をそれぞれ抑制・促進しているが，その分子メカニズムは不明なままである．
最近我々は，NOX1を発現する細胞をフリーラジカルスカベンジャー化合物で24時間処理すると，化合物の洗い出し後もNOX1活性が減弱されていることを見いだした9）．これは，NOX1活性が，自身の生成物（O2−）により正のフィードバック調節を受けていることを示唆する．以前，NOX1由来のO2−がSrcキナーゼシグナル伝達経路を介してNOX1自身のmRNAレベルの上方制御を促進する正のフィードバックループが示されたことがある12）．しかし，我々の観察では，フリーラジカルスカベンジャー化合物処理後（すなわち，NOX1活性が低下している状態）においては細胞表面のNOX1局在量の低下は認められず，また，NOXO1とNOXA1との複合体形成にも影響がみられなかった．したがって，転写レベルでの正のフィードバック調節に加えて，未知のレドックス反応経路による活性制御システムが存在しているのではないだろうか．
NOX1のノックダウンが，ヒト結腸腺がんHCT-116細胞の遊走能を増加させることから（図1C），上皮細胞遊走シグナルは，NOX1活性により調節されると考えられる．実際，フリーラジカルスカベンジャー化合物での前処理によるNOX1活性のフィードバックループの阻害は，NOX1活性の低下に伴って，上皮細胞遊走を促進させた9）．これらの結果が示唆するのは，フィードバックループで調節されるNOX1活性により粘膜損傷の修復における重要な過程である上皮細胞の遊走能を制御していることである．
NOX1活性による上皮細胞遊走の抑制は，細胞未刺激の状態で見いだされた現象である．遊離アラキドン酸による細胞刺激時には，反対にNOX1は上皮細胞遊走を促進することが報告されている6）．これは，細胞未刺激と細胞刺激時で，NOX1が異なるレドックス反応経路を用いて細胞遊走の抑制・促進に関与していることを示唆する．未刺激細胞においては，NOX1は正常な消化管構造の機能と整合性を保つために無秩序な細胞遊走を抑制し，一方，粘膜損傷時，すなわち細胞刺激時にはNOX1による遊走促進へと切り替え，速やかに損傷部位の修復にあたると考えられる（図3B）．
6. おわりに
NOX4の生理的な役割（創傷治癒時の血管新生を促進する）に対して，NOX4の過剰発現とそれに伴うレドックス反応の増強は，“望ましくない”血管新生と関連しており，NOX4の病原性につながる13）．NOX4は，糖尿病性網膜症14）および腫瘍発達15）に関係する血管新生を誘発することが報告されており，内皮細胞の遊走の促進が原因である可能性が示唆されている．NOX4は生理的および病態的血管新生の両方に関わっているのである．今後，NOX4のレドックス標的分子の同定とVEGFR-2への作用機序を明らかにすることにより，NOX4–VEGF-A/VEGFR-2シグナル伝達を標的とした内皮細胞遊走制御が実現できれば，無秩序な血管新生により引き起こされる疾患への新しい対処方法の確立も期待できるだろう．一方，NOX1については，その過剰な活性化と大腸がんの増悪との関連が指摘されていることなどを考えれば，興味深い課題として，NOX1活性の正のフィードバック調節機構や，O2−による細胞遊走の促進・抑制の切り替え機構の解明が今後求められるだろう．
NOXファミリーが定義されて20年ほどを経た現在も，その真の理解のためには課題が山積しているが，それはNOXの生理機能が多岐にわたりクロストークしているさまが次々と明らかになってくるからである．だからこそ魅力的な研究対象であると同時に，生体にとっては重要なものとして，上記のような生化学研究がNOXの生理機能の全容解明へ至る一助となることを期待するものである．
引用文献
1) Brandes, R.P., Weissmann, N., & Schröder, K. (2014) Nox family NADPH oxidases: Molecular mechanisms of activation. Free Radic. Biol. Med., 76, 208–226.
2) Nauseef, W.M. (2019) The phagocyte NOX2 NADPH oxidase in microbial killing and cell signaling. Curr. Opin. Immunol., 60, 130–140.
3) Suh, Y.A., Arnold, R.S., Lassegue, B., Shi, J., Xu, X., Sorescu, D., Chung, A.B., Griendling, K.K., & Lambeth, J.D. (1999) Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature, 401, 79–82.
4) Rokutan, K., Kawahara, T., Kuwano, Y., Tominaga, K., Sekiyama, A., & Teshima-Kondo, S. (2006) NADPH oxidases in the gastrointestinal tract: A potential role of Nox1 in innate immune response and carcinogenesis. Antioxid. Redox Signal., 8, 1573–1582.
5) Sadok, A., Bourgarel-Rey, V., Gattacceca, F., Penel, C., Lehmann, M., & Kovacic, H. (2008) Nox1-dependent superoxide production controls colon adenocarcinoma cell migration. Biochim. Biophys. Acta, 1783, 23–33.
6) Kwon, J., Wang, A., Burke, D.J., Boudreau, H.E., Lekstrom, K.J., Korzeniowska, A., Sugamata, R., Kim, Y.S., Yi, L., Ersoy, I., et al. (2016) Peroxiredoxin 6 (Prdx6) supports NADPH oxidase1 (Nox1)-based superoxide generation and cell migration. Free Radic. Biol. Med., 96, 99–115.
7) Kanegasaki, S., Nomura, Y., Nitta, N., Akiyama, S., Tamatani, T., Goshoh, Y., Yoshida, T., Sato, T., & Kikuchi, Y. (2003) A novel optical assay system for the quantitative measurement of chemotaxis. J. Immunol. Methods, 282, 1–11.
8) Miyano, K., Okamoto, S., Yamauchi, A., Kawai, C., Kajikawa, M., Kiyohara, T., Tamura, M., Taura, M., & Kuribayashi, F. (2020) The NADPH oxidase NOX4 promotes the directed migration of endothelial cells by stabilizing vascular endothelial growth factor receptor 2 protein. J. Biol. Chem., 295, 11877–11890.
9) Miyano, K., Okamoto, S., Yamauchi, A., Kajikawa, M., Kiyohara, T., Taura, M., Kawai, C., & Kuribayashi, F. (2020) Constitutive activity of NADPH oxidase 1 (Nox1) that promotes its own activity suppresses the colon epithelial cell migration. Free Radic. Res., 54, 640–648.
10) Kim, Y.W. & Byzova, T.V. (2014) Oxidative stress in angiogenesis and vascular disease. Blood, 123, 625–631.
11) Bernatchez, P.N., Soker, S., & Sirois, M.G. (1999) Vascular endothelial growth factor effect on endothelial cell proliferation, migration, and platelet-activating factor synthesis is Flk-1-dependent. J. Biol. Chem., 274, 31047–31054.
12) Sancho, P. & Fabregat, I. (2010) NADPH oxidase NOX1 controls autocrine growth of liver tumor cells through up-regulation of the epidermal growth factor receptor pathway. J. Biol. Chem., 285, 24815–24824.
13) Kuroda, J., Ago, T., Matsushima, S., Zhai, P., Schneider, M.D., & Sadoshima, J. (2010) NADPH oxidase 4 (Nox4) is a major source of oxidative stress in the failing heart. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 15565–15570.
14) Vogel, J., Kruse, C., Zhang, M., & Schröder, K. (2015) Nox4 supports proper capillary growth in exercise and retina neo-vascularization. J. Physiol., 593, 2145–2154.
15) Helfinger, V., Henke, N., Harenkamp, S., Walter, M., Epah, J., Penski, C., Mittelbronn, M., & Schröder, K. (2016) The NADPH Oxidase Nox4 mediates tumour angiogenesis. Acta Physiol. (Oxf.), 216, 435–446.
2024年11月26日 | カテゴリー：各種病因学, 癌の病態生理と治療学, 基礎知識/物理学、統計学、有機化学、数学、英語 |
